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      斑馬魚動物模型評估二甲雙胍和水飛薊素聯合治療糖尿病
      來源:中國實驗動物信息網 | 作者:李曉菲譯 | 發布時間: 1132天前 | 969 次瀏覽 | 分享到:
          本研究以斑馬魚為模型,通過葡萄糖誘發2型糖尿病,觀察二甲雙胍與水飛薊素合用對血糖升高、腸道組織、肝臟酶及炎癥標記基因TNF-α,IFN-γ,INL1β的作用。方法:在自動分析儀上檢測魚內臟勻漿上清液中的肝酶(AST、ALT和ALP)。用內部RT-PCR方法定量分析了從尾部提取的RNA上靶基因的表達,用蘇木精-伊紅染色法對小腸組織進行染色。結果:在無葡萄糖影響組,二甲雙胍和水飛薊素降低了血液中AST、ALT和ALP酶的水平。這兩種藥物聯合使用對降低血糖水平也有重要作用。在含葡萄糖誘導的對照組中,體重顯著增加,在二甲雙胍組中觀察到最低的體重增加。對照組INL-1β基因表達顯著增強,在含葡萄糖(G?+?CTRL)和不含葡萄糖(G-CTRL)的對照組中IFN-γ表達最高。在對照組+葡萄糖組(G + CTRL)中觀察到最低水平的TNF-α基因表達。 糖尿病狀態導致吸收較弱,因此魚需要通過增加酸性杯狀細胞的數量來增加吸收水平。結論:這項研究表明,二甲雙胍和水飛薊素的治療可以通過減少2型糖尿病斑馬魚模型中炎癥基因和血糖的表達,調節肝酶并改善腸道炎癥來調節代謝介導的性能。

      簡介:與不健康的生活方式和新陳代謝引起的疾病相關的2型糖尿病,肥胖癥和心血管疾病在全球范圍內已迅速發展。與肥胖和高血糖相關的疾病正成為導致死亡的主要原因。二甲雙胍是治療2型糖尿病的常用藥物之一。二甲雙胍不依賴胰島素,通過降低血糖發揮作用。二甲雙胍還通過T細胞浸潤影響免疫系統,同時減輕炎癥。水飛薊素是一種黃酮類化合物;類黃酮是多種植物營養素的植物化學物質,可以在許多水果和蔬菜中找到。水飛薊素有一種叫做水飛薊素的結構,可以保護肝臟。水飛薊素已被報道為2型糖尿病患者的有效化合物。斑馬魚是脊椎動物中與人類遺傳相似性超過85%的動物模型。斑馬魚作為代謝疾病和高血糖研究的模型建立了強大的平臺,,是糖尿病研究的前沿。斑馬魚作為2型糖尿病的模型已經被證明是一個很有前途的平臺,用于研究飲食誘導、血糖水平和胰島素抵抗的機制、治療和健康管理研究。斑馬魚被認為是一種很有前景的高血糖模型,對高糖治療有顯著反應,胰島素反應明顯可用于抗糖尿病藥物的研究。有研究表明使用二甲雙胍可以顯著增加β細胞的數量。在糖尿病和肥胖個體中發現了炎癥生物標志物基因,這些生物標志物可以預測2型糖尿病的進展。在本研究中,我們探討了化學藥物(二甲雙胍)和中藥(水飛薊素)單獨或聯合用藥跟蹤2型糖尿病誘導斑馬魚腸道炎癥反應及TNF-α、IFN-γ和IL-1β基因表達的可能性。引入一種新的草藥和化學復合物來減輕斑馬魚因高濃度葡萄糖攝取而引起的炎癥。這種新的聯合療法可以減少炎癥引起的組織損傷,改善2型糖尿病患者的血糖水平。

      實驗設計和魚群定義:隨機選取7月齡成年魚,,并將其分為兩個主要組和四個亞組。使用了八個水箱,每2升水有15條魚。所有8個魚缸保持在恒定的溶解氧下,pH值保持在7左右,溫度為28±1℃。 每條魚的平均重量為3克。每組重復3次。兩個主要實驗組為葡萄糖誘導組(G+)和(不含葡萄糖組??G-),每個主要組包括4個亞組(對照組?=?CTRL),(水飛薊素?=?Si),(二甲雙胍?Me),(水飛薊素和二甲雙胍)。????

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      試驗組準備。魚被分為兩組,分別為葡萄糖誘導組和(無葡萄糖組)。每一個都包含四個子組:CTRL、Si、Me、SiMe。每個魚缸有2升水含15條魚,魚缸在28±?1°C的恒定溫度下通過氧氣和過濾進行充氣。每隔一天更換一次水。


      制備誘導性高血糖斑馬魚:在本研究中,我們將斑馬魚作為一個高血糖模型,增加其水箱中的葡萄糖濃度。經過5天的馴化(葡萄糖誘導),逐漸將水合葡萄糖添加到水箱中來誘導魚。用濃度為50 mM的葡萄糖開始初始誘導。我們將魚飼養在該葡萄糖濃度下4天,并監測健康和死亡率,然后每天換水。在第5天,將葡萄糖濃度提高到100 mM,為了防止死亡,將魚再飼養3天,同時不斷監測情況。魚適應新的葡萄糖濃度,然后再次提高葡萄糖水平(葡萄糖誘導),,以進一步用200 mM葡萄糖誘導魚。

      二甲雙胍和水飛薊素治療:制備水飛薊素液體儲備液,并在4°C下儲存。將10滴(濃度為10 mM)添加到2 L水箱中,水箱內裝有15條魚:(G+Si)、(G+SiMe)、(G-Si)、(G-SiMe)。為了制備二甲雙胍儲備溶液,將1片500 mg 二甲雙胍片搗碎形成細粉。 輕輕收集粉末,并將其溶于10 mL RO水中,以達到精細混合。1片相當于濃度為20μL的片劑,溶于2 L水中(250 ppm),將2 ml的上述原液添加到(G + Me),(G + SiMe),(G-Me)和(G-SiMe)組,分別含15條魚的2 L魚缸中。


      斑馬魚生物特征分析:為了測量生物特征參數,隨機從每個魚缸中取出三條魚。為了避免應激效應,然后讓魚靜息1分鐘,然后在50ml RO水中用3滴丁香酚將其安樂死。測量并記錄魚的長度和重量,然后剪鰭以進行進一步的基因分析,然后立即準備進行血糖測量。用數字卡尺測量魚的長度,用微量天平測量重量。

      血糖測量和酶測定:一式兩份地進行樣品收集。采血實驗前,從每個魚缸中隨機抽取3條魚,在正常反滲透水中禁食12h,溫度和溶解氧與其他實驗魚缸相同。按照上述程序對這些魚實施安樂死。切尾,直接滴血于血糖儀上,記錄血糖。然后立即對魚進行解剖,以收集腸道樣本。分離魚器官并使用均質器均質。然后將樣品在微管中以2500 rpm(4°C)離心15分鐘。 離心后,取可溶性上清液用于測量天冬氨酸轉氨酶(AST),丙氨酸轉氨酶(ALT),鏈烷磷酸酶(ALP)。

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      魚解剖。 在進行生物特征記錄和血糖測量后立即解剖同一條魚。 b完整的腸已被移出并立即保存在10%福爾馬林中,并在4°C下保存以進行組織學檢查

      結果:體重:在肥胖的非糖尿病成人中使用二甲雙胍會導致食物攝入減少和體重減輕,同時降低空腹血糖和胰島素水平。在含葡萄糖的對照組中觀察到最高體重(BW),而在二甲雙胍組中觀察到最低體重。接受含葡萄糖誘導的對照組的體重明顯高于其他組。


      血糖測量:血糖升高會導致體重增加,血脂水平升高,胰島素抵抗和胰島素分泌受損。 此外,糖尿病患者血糖的升高還涉及從脂肪組織和其他人體組織釋放某些肽類激素,例如細胞因子。因此,降低血糖,減少副作用將對2型糖尿病患者有益。水飛薊素治療可降低血糖和胰島素分泌,對2型糖尿病合并高胰島素血癥的治療有積極作用。類黃酮是水飛薊素中的一類化合物,它除了具有很強的抗氧化性能外,還能穩定細胞膜,增加細胞谷胱甘肽,已被證明能降低血糖和改善肝臟代謝。二甲雙胍對血糖有顯著控制作用,降低血漿胰島素水平而不增加體重。二甲雙胍和胰島素聯合應用有助于肥胖的2型糖尿病患者,并能改善血糖控制,減少大約30%的外源性胰島素需求。在本研究中,觀察到含葡萄糖對照組在實驗開始和結束時的最高血糖水平,明顯高于其他組。在試驗期結束時(第20天),在用二甲雙胍,水飛薊素和二甲雙胍-水飛薊素治療的葡萄糖誘導組中觀察到最低的血糖水平。

      酶分析:在許多疾病中,藥物引起的肝酶的變化以劑量依賴的方式迅速發生,在肝臟炎癥中也起著重要作用。血液參數也被用作魚類生理應激的指標,以響應內源性或外源性變化。不同類型的糖尿病,特別是2型糖尿病,通常與脂蛋白和脂質血漿異常有關。這些脂質異常與不同的酶有關,如天冬氨酸氨基轉移酶(AST)和丙氨酸氨基轉移酶(ALT),這些酶存在于肝臟、心臟、骨骼肌、腎臟、胰腺、脾臟、紅細胞和魚鰓中。這些酶對于檢查魚類的健康狀況也很重要。結果表明在含葡萄糖的對照組中觀察到最高水平的肝酶AST。 在含有和沒有葡萄糖的兩個對照組中,實驗開始和結束時肝酶ALT的最高水平。實驗結束時,含葡萄糖二甲雙胍治療組的(ALT)酶水平最低。在實驗開始和結束時,在含葡萄糖的對照組中也發現了最高水平的肝酶堿性磷酸酶(ALP)。在實驗結束時,在含葡萄糖的二甲雙胍治療組和二甲雙胍組中發現該酶的最低水平。

      腸組織分析:在發育過程中,小腸絨毛的高度在出生后增加。研究表明,糖尿病患者絨毛高度與腸道吸收能力有直接關系。水飛薊素聯合二甲雙胍組絨毛高度最大,明顯高于其他組??梢缘贸鼋Y論,水飛薊素和二甲雙胍通過腸粘膜愈合中描述的機制參與改善血液供應,并且能夠使粘膜粘附恢復到以前的狀態。絨毛寬度以水飛薊素組最高,含葡萄糖二甲雙胍組最低。水飛薊素治療組與對照組比較差異有顯著性。研究組之間的粘膜下直徑評估均未發現任何顯著差異。分泌的粘液類型根據魚的種類和胃腸道的不同途徑而不同,并且腸粘膜的質量與環境條件以及進食通道功能的類型完全相關。含葡萄糖水飛薊素組肌肉直徑最大,與其他組比較有顯著性差異。

      結論:魚類空腹血糖和胰島素抵抗增加,斑馬魚是研究2型糖尿病炎癥、毒性和基因表達的一種很有前途的動物模型。研究結果表明,在使用二甲雙胍和水飛薊素治療的20天中,血糖和高濃度葡萄糖引起的炎癥有顯著改善。與其他哺乳動物模型相比,我們的斑馬魚模型提供了快速的T2DM模型。本研究開發的新的治療T2DM的聯合療法有效、快速,可用于T2DM的早期研究。為進一步研究糖尿病藥物的發現和毒性研究提供了一個新的有用的工具。


      原文出自:https://link.springer.com/article/10.1007/s40200-020-00637-7

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