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      斑馬魚作為體內篩選模式生物:確定PARP抑制劑的有效性
      來源:DNA Repair Available online 12 November 2020, 103023 | 作者:李曉菲譯 | 發布時間: 1118天前 | 692 次瀏覽 | 分享到:

      通過同源重組(HR)進行雙鏈斷裂(DSB)的修復對于維持細胞基因組的穩定性至關重要。HR途徑的突變增加了乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌的風險。PARP抑制劑(PARPi)是專門針對缺乏HR的腫瘤的化合物。 新型PARPi一直在開發中,但研究仍集中在體外數據上。需要一種能夠:1)提供體內數據,2)在新型PARPi開發過程的早期3)提供快速結果,4)成本低廉的檢測方法。在這里,提出了一種結合體內斑馬魚實驗來準確量化PARP抑制劑療效的方法。發現PARPi在斑馬魚中表現出功能性作用,通常與它們的PARP捕獲能力相關。此外展示了Olaparib介導的放射增敏在斑馬魚模型中如何保守。該方法可為新型PARPi的開發提供早期的體內數據。此外,使用斑馬魚可以進行聯合療法的高通量試驗,以尋找新的治療策略。

      關鍵詞:斑馬魚  PARP抑制劑  同源重組  輻照

      簡介:細胞中的DNA不斷受到內源性或外源性來源的破壞。尤其是DNA雙鏈斷裂(DSBs)是有毒的,因為不能修復這種損傷會導致染色體斷裂、重排、缺失、細胞死亡甚至癌癥。要修復DSBs,有兩種主要途徑,經典的非同源末端連接(c-NHEJ)和同源重組(HR)。c-NHEJ用最少的末端處理重新連接斷裂的DNA末端,這可能導致小的插入或缺失。相比之下,HR需要對斷裂進行廣泛的末端切除,并使用未損壞的姐妹染色單體作為模板進行無誤修復。維持這些通路的完整性對于維持體內平衡至關重要。HR通路的關鍵基因是BRCA1和BRCA2。種系BRCA1 / 2突變的雜合子攜帶者顯著提高了乳腺癌,卵巢癌,前列腺癌和胰腺癌的風險。這些癌癥是由體細胞中第二等位基因失活引起的,導致HR缺陷,基因組不穩定,最終導致腫瘤發生。


      聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)是一組參與DNA損傷修復的蛋白質。已經描述了幾種PARP蛋白,其中PARP1在單鏈斷裂(SSB)修復中特別重要。單鏈斷裂后,PARP1以稱為“ PARylation”的過程結合DNA并合成Poly ADP-核糖鏈。 該過程募集了與SSB修復有關的其他蛋白質,在這些蛋白質的作用下,修復了損傷并維持了細胞活力。PARP抑制劑(PARPi)是一類通過抑制PARP的催化活性或將PARP捕獲到受損DNA上而起作用的一類化合物。結果,防止了SSB的修復。 在復制單元中,這些未修復的SSB導致復制叉崩潰,并轉換為單端DSBs。由于這些斷裂的結構,它們不適合通過c-NHEJ進行修復。相反,用HR來修復單端DSB并重新啟動復制叉。在缺乏功能性HR的細胞中(與BRCA1 / 2相關的腫瘤就是這種情況),這些未重新啟動的復制叉無法分解,DSB積聚,細胞毒性隨之產生。因此,抑制PARP會導致HR缺陷細胞的細胞死亡,而具有HR能力的細胞則可以適當修復損傷。通過消耗兩條途徑(在這種情況下為SSB修復和HR)有選擇地殺死細胞的原理稱為“合成殺傷力”。 目前正在臨床應用一些PARPi,來治療伴有HR相關缺陷的多種癌癥。新型PARPi正在不斷開發中,目的是發現具有更高PARP-1選擇性且副作用更少的更有效的藥物。建立PARPi功效的大多數臨床前工作都依賴于體外測定,僅在后期驗證中使用小鼠異種移植進行體內驗證。雖然小鼠異種移植模型對于建立PARPi的療效至關重要,但是它們昂貴,耗時,因此只能在PARPi驗證過程的后期使用。因此需要一種能夠:1)提供體內數據,2)在PARPi開發過程中的早期,3)提供快速結果和4)成本低廉的檢測方法。


      斑馬魚由于其低飼養成本、初始光學透明性和易于進行基因改造而越來越多地用于癌癥研究。斑馬魚目前正在成為研究DNA損傷和修復的重要模型生物。人類和斑馬魚之間有幾個途徑是非常保守的,如核苷酸切除修復、堿基切除修復、c-NHEJ和HR。我們的小組以前研究發現,斑馬魚的HR途徑可以通過Rad51 foci的免疫熒光染色來可視化和量化,Rad51 foci在HR修復過程中與Brca2形成復合物。在本文中,我們證明了brca2-/-突變斑馬魚對PARPi處理的敏感性。 這種敏感性可用作新PARPi的初始篩選工具。此外,我們描述了Rad51foci測定法如何準確定量斑馬魚中PARPi的功效。通過測量由應用PARPi引起的復制叉重新啟動期間形成的Rad51 foci的數量,可以量化該功效。 Rad51 foci的形成與PARPi暴露和活性明確相關。最后,我們演示了斑馬魚如何與其他療法結合用于測試PARPi的功效。


      結果:眼睛大小測試揭示PARPi對brca2-/-突變體的毒性:缺乏HR的癌細胞長期暴露于PARPi會導致DNA損傷積累和細胞死亡。為評估HR缺乏斑馬魚的這種毒性,將brca2+/-魚雜交,并在受精后6小時(hpf)將后代暴露于不同濃度的Olaparib。在72hpf時,用5μM或10μM Olaparib處理過的brca2 + / +和brca2 +/-幼蟲看起來正常,而brca2-/-突變體顯示出嚴重的發育畸形(小眼睛,彎曲的尾巴,后腦浮腫,圖1A)。作為定量標記,我們對幼蟲進行了橫向定位,并測量了它們的眼睛大小。未經處理的brca2-/-突變體的眼睛大小與野生型沒有統計學差異。然而,在用5和10μM Olaparib處理后,brca2-/-突變體的眼睛明顯小于野生型,表明其具有合成致死毒性。在更高濃度(20μM)下,我們觀察到所有組的嚴重毒性。我們還對Talazoparib,Niraparib和Veliparib進行了這個實驗。觀察到Talazoparib的眼睛大小從0.5μM開始減小。而Niraparib的眼睛大小從則從5μM開始減?。▓D1D)。對于Veliparib,我們只能在非常高的劑量下觀察到眼睛大小的微小變化。


      圖1、brca2-/-突變體幼蟲對Olaparib治療敏感。A) 在6hpf下,將brca2+/-胚胎的雜交體暴露在5μM的Olaparib中,在52hpf時更換Olaparib。在72hpf時,對brca2+/+和brca2-/-幼蟲進行了形態學比較。brca2-/-幼蟲眼睛較小,尾巴彎曲,后腦水腫(黑色箭頭)。B-E)暴露于不同劑量的Olaparib(B),Talazoparib(C),Niraparib(D)和Veliparib(E)的brca2胚胎中眼睛的相對大小。在72hpf時,對基因型之間的眼睛大小進行量化(眼睛大小測試)。數據標準化為未經處理的brca2+/+幼蟲。每種情況至少包括3只幼蟲。


      吖啶橙檢測顯示PARPi處理的斑馬魚brca2-/-突變株的細胞死亡增加:為了直接觀察PARPi對胚胎細胞死亡的影響,我們進行了吖啶橙試驗。簡而言之,將brca2 +/-魚雜交,將6hpf的胚胎暴露于幾種濃度的Olaparib中。在24hpf條件下,用吖啶橙法觀察細胞死亡情況。二甲基亞砜處理的brca2-/-胚胎沒有表現出比野生型更多的凋亡細胞。然而,與野生型相比,用1μM Olaparib處理可導致brca2-/-胚胎中的凋亡細胞增加約3倍。在2μM處,細胞死亡甚至更高,突變體的凋亡細胞數是對照組的7.5倍。在較大劑量下,brca2 + / +和brca2 +/-胚胎的細胞死亡水平也升高。我們還對Talazoparib,Niraparib和Veliparib進行了吖啶橙分析。 對于Talazoparib,brca2-/-特異性細胞死亡發生在0.5μM,但是在0.75μM時,brca2 + / +和brca2 +/-胚胎也都發生了損傷。

      圖2、用Olaparib(A),Talazoparib(B),Niraparib(C)和Veliparib(D)處理的brca2cmg35胚胎的吖啶橙分析。 在每種情況下至少包含3個胚胎。 這表明Talazoparib在合成致死性和一般毒性之間的劑量范圍非常狹窄。 Niraparib在5μM在5μM處表現出最佳的合成致死效應。盡管使用了非常高的濃度,Veliparib并未顯示出任何增加的brca2-/-特異性細胞死亡??傊?,斑馬魚的brca2-/-突變體在PARPi暴露后會發生細胞死亡。


      Rad51foci檢測證明Olaparib誘導DSB后HR途徑上調:以前的研究表明brca2-/-突變體對PARPi治療敏感。接下來,想評估PARPi誘導的細胞死亡是否是由正在進行細胞分裂的斑馬魚細胞中DSBs的上調引起的。為此,我們將72hpf Tg(EF1a:mCherry-zGem)oki011胚胎暴露于不同濃度的Olaparib中7小時,然后進行γH2AX foci測定。該分析可以顯示在細胞周期晚期S/G2期復制叉重啟期間形成的DSBs。我們專注于72hpf幼蟲的大腸細胞,因為這個組織在這個時間點增殖性很強。盡管用DMSO處理的胚胎僅表現出少量的γH2AX foci,但在用Olaparib處理的幼蟲中其明顯上調。主要在Geminin陽性細胞中觀察到γH2AX foci。 得出的結論是,Olapaparib在分裂細胞中誘導DSB。接下來,我們調查了是否可以通過HR途徑修復Olaparib誘導的DSB。Tg(EF1a:mCherry-zGem)oki011胚胎具有很高的HR,因此可以使用Rad51 foci分析來量化HR的數量。雖然用DMSO處理的幼蟲細胞未顯示Rad51 foci(圖3A),但暴露于Olaparib的幼蟲在Geminin陽性細胞中顯示出Rad51 foci數量增加。對不同濃度的分析顯示出明顯的劑量依賴性反應,使用400μM Olaparib可發現最大數量的Rad51 foci。隨后調查了HR缺陷型brca2-/-幼蟲在PARPi治療中Rad51 foci的水平。不出所料,雖然brca2 + / +和brca2 +/-胚胎均顯示Rad51 foci的上調水平,但brca2-/-突變體幾乎未顯示Rad51 foci,表明這些魚中的DSB不能正確修復??傊?,暴露于Olaparib會導致DSB的產生,隨后通過HR對其進行修復。

      圖3. PARPi處理可誘導HR途徑良好的幼蟲產生Rad51 foci。藍色:DAPI,紅色:Geminin,綠色:Rad51。 (B)暴露于400μMOlaparib的幼蟲切片。(C)Olaparib的劑量反應曲線。 每個條件至少包括3個幼蟲。(D)將雜交的brca2 +/- 72hpf幼蟲暴露于400μM中7小時,然后進行Rad51 foci測定。 將處理過的brca2 + / +幼蟲的數據標準化。每個條件至少包括3個幼蟲。(E) 72hpf-Tg(EF1a:mCherry-zGem)oki011幼蟲用于比較Olaparib、Talazoparib、Niraparib和Veliparib在400μM暴露(300μM Talazoparib)和5μM暴露。每種條件至少包括4只幼蟲。


      Rad51foci分析揭示了PARPi在通過HR誘導修復中的差異:由于PARPi抑制或捕獲PARP的能力不同,因此我們假設可以通過評估發生的HR修復量在斑馬魚中捕獲這些差異。在斑馬魚中評估了相同的四種臨床可用的PARPi(Olaparib, Niraparib, Veliparib, 和Talazoparib)及其誘導Rad51 foci的能力。為此,將72hpf Tg(EF1a:mCherry-zGem)oki011幼蟲暴露于400μM的每種PARPi中,因為該劑量顯示了olaparib的最大作用(由于溶解度問題,對于Talazoparib僅使用300μM)。隨后,魚在暴露7小時后被固定。與二甲基亞砜對照組相比,Olaparib, Niraparib, Veliparib, 和Talazoparib處理的Rad51foci增加了15倍。相比之下,Veliparib只誘導了4倍多的Rad51foci。這很可能反映了它作為PARP的較弱捕捉者的地位。Talazoparib被認為是最有效的PARPi之一。為了確認這種效力在我們的體內斑馬魚模型中是保守的,我們將Olaparib,Talazoparib和Niraparib的劑量降至5μM,并評估了Rad51 foci的數量。在這個劑量下,Olaparib, Niraparib僅顯示Rad51 foci的適度增加。 相反,Talazoparib仍顯示出明顯更多的foci??傊?,斑馬魚的Rad51病灶分析可以用來研究PARPi的療效。


      斑馬魚是評價PARPi聯合放射效果的理想模式生物:除了PARPi單一療法外,將PARPi與其他治療相結合的最終目標是增加對腫瘤組織的細胞毒性。在這項研究中,我們調查了Olaparib的放射增敏作用。為此,收集了雜交的brca2 +/-胚胎,并在6hpf時與400μM Olaparib脈沖,5 Gy IR,Olapaparib和IR的組合或DMSO對照孵育。 在24hpf時觀察胚胎,應用吖啶橙法。所有接受Olaparib脈沖的胚胎看起來都很正常,但是吖啶橙分析確實顯示brca2-/-胚胎的凋亡細胞比野生型增加了2.5倍。所有接受5?Gy照射(IR)的胚胎顯示大腦輕微的不透明。吖啶橙分析顯示,與未放射對照組相比,凋亡細胞顯著增加,與brca2基因型無關。另一方面,Olaparib脈沖和IR聯合應用可導致嚴重的形態學畸形。在這種情況下,由于損傷太嚴重而不能應用吖啶橙法。數據表明,Olaparib對斑馬魚的放射增敏作用不依賴于brca2等位基因的存在。綜上所述,我們的研究表明,斑馬魚可以用來測試PARPi與放射聯合的療效。

      圖4、Olaparib可使斑馬魚放射增敏。(A) 將brca2+/-6hpf雜交胚胎暴露于400μM Olabarib中30?分鐘。在24小時時,應用吖啶橙測定法。每個條件至少包括6個胚胎。(B)用5 -Gy放射雜交的brca2 +/- 6hpf胚胎。 在24hpf下進行吖啶橙測定。 每個條件至少包括5個胚胎。(C)Olaparib脈沖,放射、Olaparib和放射組合后的24hpf胚胎的圖像。Olaparib脈沖不引起視覺形態畸形。 5 Gy IR單一療法會導致大腦輕微不透明(藍色箭頭)。Olaparib結合IR會導致嚴重的形態畸形,例如眼球縮小,大腦變小和尾巴彎曲(黑色箭頭)。


      結論:我們開發了一種體內工具來準確預測PARP抑制劑在斑馬魚體內的有效性。禁用HR后,斑馬魚對PARPi表現出細胞毒性。如Rad51 foci形成所示,在PARPi存在下,HR途徑上調。 諸如PARPi放射增敏的組合療法可在斑馬魚中復制。我們的實驗結果可能有助于新型PARPi的進一步開發,提供早期的體內數據。此外,斑馬魚幼蟲的使用為聯合療法的快速和高通量測試為尋求新穎的治療策略打開了大門。

      原文出自:Zebrafish as an in vivo screening tool to establish PARP inhibitor efficacy - ScienceDirect

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