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      一種新型的基于 Trmt5 缺陷引發的具有自發性炎癥性腸病樣表型的斑馬魚模型
      來源:原創 | 作者:service | 發布時間: 272天前 | 268 次瀏覽 | 分享到:
      炎癥性腸病在斑馬魚上具有傳統的研究歷史,除了基因缺陷能夠引起的相關疾病以外,常見的TNBS等一類藥物也能在斑馬魚上誘導相應的模型。斑馬魚豐富的免疫細胞標記品系,以及炎癥誘導效應品系(Tg(nfκb:EGFP))能夠為炎癥性腸病的發病機理研究提供強有力的支持。

      導讀

      一種新型的基于 Trmt5 缺陷引發的具有自發性炎癥性腸病樣表型的斑馬魚模型

      炎癥性腸病 (IBD) 是一種以胃腸道慢性炎癥為特征的復雜綜合征,研究者使用 CRISPR-Cas9 方法,基于 tRNA 甲基轉移酶 5 ( trmt5 ) 基因生成了能夠存活的trmt5 -/-斑馬魚作為一種新型斑馬魚 IBD 模型。

      通過對trmt5 -/-斑馬魚與野生型斑馬魚(WT)進行對比發現:trmt5?/?的腸上皮減少,腸皺襞結構消失,上皮扁平,細胞核定位紊亂,杯狀細胞減少(圖1a和圖1b);腸上皮細胞中觀察到微絨毛被破壞和縮短,腸上皮細胞 (IEC) 的緊密連接和粘附連接有缺陷(圖1c)中腸中杯狀細胞數量減少(圖1d)。

      吞咽活性測定以及油紅O染色測定結果發現:trmt5?/?突變體中右旋糖酐-FITC   在10 dpf (減少60%)和16 dpf (減少90%)時顯著減少(圖 1e )。16 dpf時trmt5 -/-斑馬魚的前腸區發現了明顯的脂質ORO染色信號,表明腸道脂質代謝中斷(圖1f)。這些數據表明:突變表型主要為后期發育缺陷,反映了trmt5對幼魚發育后期階段維持腸道功能的重要性。

      a:斑馬魚內臟在 5 dpf、10 dpf 和 16 dpf 時的代表性解剖圖;b:在不同時間點對應于兩種基因型幼蟲的腸球或中腸的矢狀切片的代表性蘇木精-伊紅染色,紅色箭頭表示中腸中的杯狀細胞;c :16 dpf 時trmt5 -/-和trmt5 +/+腸上皮細胞的 TEM 分析。trmt5 -/- IHC 表現出比野生型對照更短的微絨毛(紅色箭頭);d:16 dpf 中腸矢狀切面的阿爾新藍染色;e:在 28.5 °C 下與 1% 葡聚糖-FITC 孵育 4 小時后斑馬魚消化器官的體內成像;f:油紅 O (ORO) 染色用于 16 dpf 的中性脂質積累,左圖為整片 ORO 染色,右圖為冷凍切片。圖a-f 

      應用 RNA 測序分析16 dpf 的trmt5 -/-斑馬魚與野生型斑馬魚,結果顯示trmt5 -/-斑馬魚:有 1211 個上調和 3679 個下調的不同表達基因(DEGs)(圖 1g);腸道與 IBD 相關基因的失調(圖 1h)。在免疫應答和細菌、病毒感染過程中,上調的DEGs顯著富集(圖1i)。通過中性粒細胞特異性轉基因斑馬魚品系(Tg (mpx: EGFP)),以及qRT-PCR分析巨噬細胞和自然殺傷細胞(NK),也證明了trmt5的缺失會導致幼魚后期腸中中性粒細胞的募集(圖1j)。

      應用 16s rDNA 擴增測序,結果顯示 trmt5 ?/?斑馬魚中:腸道微生物多樣性顯著降低(圖1k);微生物群存在顯著差異(圖1l);其腸道微生物組組成在類和科水平上都發生了變化(圖1m)。STAMP分析表明:trmt5 -/-突變體在γ-變形菌門中表現出相對豐度增加,而被稱為益生菌菌株和抑制炎癥的乳桿菌科的相對豐度降低??傊?,這些發現表明trmt5 -/-斑馬魚表現出IBD的一些標志性特征,這更可能代表人類克羅恩病。

      圖g-m

      G:差異表達基因 (DEG) 的火山圖,紅色和藍色圖分別表示上調和下調的 DEG;h :IBD 相關 DEG熱圖;i:與trmt5 +/+相比,trmt5?/?中 29 個上調免疫相關基因的圓形熱圖; j:7 dpf、10 dpf 和 16 dpf的trmt5 ?/?和trmt5 +/+ Tg (mpx: EGFP)轉基因幼蟲的整體裝載。Tg (mpx: EGFP)是中性粒細胞特異性轉基因系。清晰分散的綠點(由紅色箭頭表示)代表嗜中性粒細胞,而彌散的綠色信號(由黑色星號表示)是斑馬魚腹腔的背景噪音;k:trmt5 ?/?和trmt5 +/+腸道微生物群的阿爾法多樣性比較;P:表示顯著性 (** p ?< 0.01, *** p ?< 0.001);l :UniFrac主坐標分析(PCoA)分析:m:trmt5 ?/?和trmt5 +/+家族水平的腸道微生物群的宏基因組分析。

      在trmt5 -/-突變體的腸上皮細胞中觀察到異常和細長的線粒體形態(圖 1n),以及COX 和 SDH 的酶活性降低(圖1o)。這暗示了trmt5 ?/?腸中的 OXPHOS 缺乏。因此導致trmt5 -/-腸中 ATP 的產生減少和 ROS 的過量產生(圖 1p,1q)。此外,在trmt5?/?突變體中發現了線粒體未折疊蛋白反應(UPRmt)的激活,線粒體熱休克蛋白(Hsp60)在trmt5?/?斑馬魚中顯著上調,該蛋白驅動UPRmt,被認為是IBD的重要驅動因素。這些數據表明:trmt5的缺失導致斑馬魚腸道線粒體功能障礙。這可能是自發發展的IBD-like表現型的原因。

      圖n-r

      n: 通過Tg(Xla.Eef1a:MLS-EGFP)轉基因幼蟲比較trmt5 -/-trmt5 +/+在16 dpf 的線粒體形態,Tg (Xla.Eef1a: MLS-EGFP)表達線粒體靶向EGFP,細胞核與 DAPI(藍色)共染色;o:16 dpf 的腸 COX/SDH 染色;p:16 dpf 時的相對總 ATP 產量;q: 16 dpf 時通過 DCFH-DA 染色檢查 ROS 的產生;r:參與 UPR mt的蛋白質的表達水平,包括 Hsp60、Afg3l2 和 Lonp1。

      作者通過實驗還表明,乳桿菌GG (LGG)對trmt5?/?幼魚有保護作用:緩解了IBD樣表型(圖1s);顯著降低促炎基因lect2l的表達(圖1t), 明顯改善吞咽活動 (圖1u),以及延長的中位生存期(圖1v)


      圖s-v

      s:實驗設計的示意圖,兩組斑馬魚在 16 dpf 時促炎基因的t mRNA 表達;u: FITC 標記的葡聚糖在16 dpf 處檢測到吞咽活動;v:在trmt5 ?/?斑馬魚中每天喂食LGG后,存活率顯著延長。

      結論:本研究在斑馬魚中產生了第一個 Trmt5 缺陷脊椎動物系,該系具有自發發展的人類 IBD 病理特征。進一步的研究表明,通過類似于 IBD 治療策略能夠使該系表型得到部分緩解。因此建議trmt5 -/-斑馬魚可作為研究 IBD 發病機制的疾病模型,以及開發和評估潛在治療干預措施的平臺。

      點評:炎癥性腸病在斑馬魚上具有傳統的研究歷史,除了基因缺陷能夠引起的相關疾病以外,常見的TNBS等一類藥物也能在斑馬魚上誘導相應的模型。斑馬魚豐富的免疫細胞標記品系,以及炎癥誘導效應品系(Tg(nfκb:EGFP))能夠為炎癥性腸病的發病機理研究提供強有力的支持。


      文章作者:浙江大學醫學院博士后趙瓊和博士研究生?;蹫楣餐谝蛔髡?,陳燁教授為論文通訊作者,中國醫學科學院趙春華教授和浙江大學生命科學學院邵建忠教授為共同通訊作者。

      原文鏈接:https://www.nature.com/articles/s41392-023-01318-6

       

       

       

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