斑馬魚基因編輯技術服務

項目介紹

百維斯生物具有多年斑馬魚基因編輯技術經驗，提供全流程目的基因編輯服務，包括從同源基因分析到基因拯救的各個步驟。利用斑馬魚的優勢，及公司專業的基因編輯技術，可快速構建斑馬魚各基因編輯模型，基因敲降及過表達項目縮短至一個月，斑馬魚敲除、tol2轉基因制備、定點定向模型構建可在5至6個月內實現，大大縮短基因編輯實驗周期。

斑馬魚的優勢

?   斑馬魚體積小，幼魚體長只有 1–3mm，可使用96孔微孔板進行高通量全自動化分析

?   成本低，占地空間?。?span lang="EN-US">100 平米空間可養殖 30000 只成魚）

?   藥物用量少（微克級），僅為鼠類實驗的1/100至1/1000

?   體外發育，極易獲得用于生物醫學研究和藥物實驗的動物樣本

?   產卵量大，每只雌魚每周產卵可達 300–500 枚，全年周而復始

?   發育迅速，受精后24h主要器官已建成，受精后2–5天，類似于人體的主要器官均已工作，如心臟，腦，血液，血管，胰腺，肝臟等

?   身體透明，受精后前 7 天內部器官清晰可見，有節律心跳和血液循環

?   實驗周期短，大部分實驗能夠在 1–2 周內完成，而傳統體內實驗通常需要 1 個月以上

?   斑馬魚和人類的疾病信號轉導通路高度保守，斑馬魚與人類同源基因比例高達 87%，某些疾病相關基因與人類基因保守性高達 99%，這意味著在其身上做藥物實驗所得到的結果在多數情況下也適用于人體。

服務內容：

1. 基因敲降：為觀察目的基因的敲降對早期胚胎發育的影響，利用創新的 CRISPR/CasRx knockdown 技術，瞬時破壞基因的編碼序列，從而降低基因的表達水平來研究基因的功能，用于各個階段的基因功能研究。

2. 基因過表達：為觀察目的基因的過表達對早期胚胎發育的影響，通過構建目的基因過表達載體，體外轉錄合成相應的mRNA, 將mRNA  以不同劑量注射到早期胚胎中，即可研究目的基因過表達對胚胎發育及組織器官形成的影響。

3. 斑馬魚基因敲除：針對靶基因序列設計guide RNA, 指導Cas9 蛋白在特定基因位點引起DNA雙鏈斷裂，在體內修復斷裂DNA的過程中，靶點附近產生堿基隨機插入或缺失突變，最終導致目的基因功能缺失，從而達到基因敲除的目的。

4. 斑馬魚轉基因品系構建：將外源基因隨機整合到斑馬魚基因組中，在已知的啟動子信息下可用于標記特定器官和細胞、指示特定基因的表達模式、調節特定基因的表達及功能水平等。

5. 斑馬魚定點突變構建服務：定點插入外源核酸片段，用于標記基因的精準表達模式，構建點突變，實現時間空間上控制基因表達等。

技術原理:

CRISPR/CasRx knockdown 技術原理

基因敲除技術原理

轉基因技術原理

服務流程

案例展示

1、體內驗證某基因對血管生成有促進作用，采用血管熒光斑馬魚品系(VEGFR2:GFP)胚胎進行敲降實驗，可見斑馬魚節間血管數量顯著少于對照組，從而驗證該基因對血管的功能作用。

2、驗證CRISPR/CasRx 對外源報告基因EGFP的剪切效果，可見CRISPR/CasRx 能高效剪切外源報告基因EGFP。

3、混合系白血病1 (MLL1)基因在早期胚胎發育和造血中起著至關重要的作用。 MLL-AF9融合基因是染色體易位所致，常導致急性髓系白血病，預后差在較差。

研究者在斑馬魚胚胎中過表達人MLL-AF9融合基因相應mRNA，發現其過表達導致了斑馬魚的造血功能異常。

部分結果如下：

(a) Western Blot結果表明，與對照組相比，過表達時胚胎中MLL蛋白含量顯著增加；

(b) 定量PCR結果顯示，MLL下游基因表達量顯著上升；

(c-e) 整體原位雜交分析MLL下游基因表達變化；

(f-h) 過表達MLL-AF9 mRNA時，髓系細胞標記基因l-plastin, mpy和lyz表達量增加。

常見問題

1、基因敲除的 sgRNA 如何設計？

sgRNA 的設計需要遵循以下原則：

1）不影響其他基因，尤其是編碼蛋白的基因。

2）盡可能影響所有的轉錄本，敲除位點最好在編碼區的前 50%，但避免敲除 ATG 所在外顯子或 ATG 之 前的外顯子。

3）片段敲除的 sgRNA 設計在內含子上，這樣能敲除整個外顯子區，避免翻譯出殘留蛋白。

4）在設計 sgRNA 時要綜合考慮候選編輯位點的序列、位置、正負鏈、GC 含量、潛在的脫靶位點等信息。例如靶點的 GC%盡量不要低于 40%，靶點序列 GC%偏高（50%~70%）有較高的打靶效率；靶點內不 要有連續 4 個以上的 T 堿基，避免形成 RNA Pol III 的轉錄終止信號等。

2、斑馬魚胚胎顯微注射實驗操作方法

斑馬魚顯微注射是將實驗材料直接注射到1-4細胞期的斑馬魚胚胎中，由于在這個胚胎發育早期沒有膜分隔細胞和卵黃，注入1個細胞或卵黃的溶液將擴散到整個胚胎中。通過注射不同類型的實驗樣品，實現基因的瞬時過表達、表達敲降、以及制備轉基因或突變斑馬魚品系等研究。

3、顯微注射的注意事項

顯微注射的操作過程中有許多細節影響實驗的成功率，主要包括以下幾方面。

1）注射樣品的質量和和濃度。

2）注射前小心將顯微注射針定位，注射針定位到卵表面的注射角度是穿透堅硬的卵殼注射成功的關鍵。

3）破針時，將針尖一點點剪斷，不宜一次剪太多。

4）注射時注射器的壓力不宜變化太快，否則會造成注射量操作難以控制，導致胚胎內環境改變過快過大甚至脹破細胞。氮氣罐的壓力閥顯示氣體的壓力，壓力為0表明罐內無氣體，需要及時換氣。

5）注射完畢，慢慢抽出注射針，避免受精卵內物質隨著毛細針抽出，造成受精卵的損傷。